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Dr. Lukas Theo Schmitt

Preisträger 2023 Stufe Promotion - Technische Universität Dresden, Medizinische Fakultät

Prediction of designer-recombinases for DNA editing with generative deep learning

Kurzbeschreibung

Preisträger Lukas Theo Schmitt bei der Preisverleihung des DRESDEN EXCELLENCE AWARD

Ortsspezifische Rekombinasen vom Tyrosin-Typ sind wirksame Werkzeuge für das Genom-Engineering, und die ersten konstruierten Varianten haben therapeutisches Potenzial gezeigt. Bisher wurde die Anpassung an eine neue DNA-Zielstellenselektivität von Designer-Rekombinasen hauptsächlich durch iterative Zyklen der gerichteten molekularen Evolution erreicht. Die Methoden der gerichteten molekularen Evolution sind zwar effektiv, aber mühsam und zeitaufwendig.

Um die Entwicklung von Designer-Rekombinasen zu beschleunigen, habe ich zwei Sequenzierungsansätze evaluiert und die Sequenzinformationen von über zwei Millionen Cre-ähnlichen Rekombinase-Sequenzen gesammelt, die für 89 verschiedene Zielstellen entwickelt wurden. Mit diesen Informationen untersuchte ich zunächst die Sequenzzusammensetzung und die Veränderungen der Reste der Rekombinasen, um die Selektivität ihrer Zielorte besser zu verstehen. Die Komplexität der Daten führte mich zu einem generativen Deep-Learning-Ansatz. Anhand der Sequenzdaten trainierte ich einen bedingten Variations-Autoencoder namens RecGen (Recombinase Generator), der in der Lage ist, neue Rekombinasen für eine bestimmte Zielstelle zu generieren. Durch rechnerische Auswertung der Sequenzen konnte ich zeigen, dass bekannte Rekombinasen, die an der gewünschten Zielstelle funktionieren, den von RecGen vorhergesagten Rekombinasen im Allgemeinen ähnlicher sind als andere Rekombinasenbibliotheken.

Außerdem konnte ich experimentell zeigen, dass vorhergesagte Rekombinasen für bekannte Zielstellen mindestens so aktiv sind wie die entwickelten Rekombinasen. Schließlich konnte ich auch experimentell zeigen, dass 4 von 10 Rekombinasen, die für neue Zielorte vorhergesagt wurden, in der Lage sind, ihre jeweiligen Zielorte auszuschneiden.

Als Bonus zu RecGen habe ich auch eine neue Methode entwickelt, die eine genaue Sequenzierung von Rekombinasen mit Nanoporen-Sequenzierung ermöglicht und gleichzeitig DNA-Editing-Ereignisse zählt. Die Daten dieser Methode sollten die nächste Entwicklungsstufe von RecGen ermöglichen.

Botschaft für den DRESDEN EXCELLENCE AWARD

In den letzten 10 Jahren hat das Thema Gentherapie stark an Relevanz gewonnen. Durch die Entdeckung von CRISPR-Cas wurde das Behandeln von vielen genetischen Krankheiten möglich gemacht. Während CRISPR-Cas-Enzyme sehr flexible sind, so haben sie doch einige Limitationen. Viele dieser Limitationen haben Ortsspezifische Rekombinasen vom Tyrosin-Typ nicht. Sie sind wesentlich kleiner, brauchen keine DNS-Reperaturmechanismen und ihre DNS-Veränderungen sind sehr präzise. Zudem sind sie in der Lage DNS auszuschneiden, zu invertieren, einzufügen oder auszutauschen. Rekombinasen sind damit für eine weite Anzahl an Anwendungen brauchbar und somit ideale Enzyme für die Gentherapie.

Der große Nachteil von Ortsspezifische Rekombinasen ist ihre geringe Flexibilität sie an neue DNSZielsequenz anzupassen. Hierfür wurde von Prof. Dr. Frank Buchholz eine Anwendung der zielgerichteten Evolution entwickelt, welche seit vielen Jahren verwendet wird, um neue Rekombinasen zu erstellen. Prominente Beispiele sind die Rekombinasen Brec1, für das Ausschneiden vom HIV-Provirus, und RecF8, für das Invertieren und Korrigieren einer DNSSequenz, welche Hämophilie A auslöst. Während die zielgerichtete Evolution von Rekombinasen sehr effektiv ist, so bedarf sie hohem Arbeits- und Zeitaufwand, was die breite Anwendung für gentherapeutische Zwecke limitiert.

Um die Entwicklung von neuen Rekombinasen zu beschleunigen, habe ich einen intelligenten Ansatz der Enzymentwicklung erforscht. Hierfür habe ich über zwei Millionen evolviert Rekombinasengene sequenziert und die Daten genutzt, um das Verständnis der Rekombinasen zu verbessern. Aufgrund dieses Ansatzes habe ich dann ein generatives "Deep Learning" Model trainiert, um funktionale Rekombinasen vorherzusagen.

Mit diesen Computermodellen wurden zehn Rekombinasen für neue Zielsequenzen generiert von welchen vier funktional waren. Dies bewies, dass das intelligente Design von neuen Rekombinasen möglich ist. Zudem war die Generation von Proteinsequenzen aufgrund einer Zielsequenz durch einen Computer eine Errungenschaft, welche bisher noch nicht erreicht wurde. Diese Vorhersagen können die Entwicklungszeit von Rekombinasen um mehrere Wochen verkürzen. Ende 2022 wurde diese Arbeit in einer Publikation in "Nature Communications" veröffentlicht, welches zeigt wie relevant diese Erkenntnisse in der Wissenschaftlichen Welt sind.

Währenddessen entwickelte ich eine neue Methode, um die nächste Generation von Vorhersagemodellen zu erstellen. Ein wesentlicher Bestandteil eines solchen Models basiert auf den Daten, mit welchem es trainiert wurde. Soweit, wurden nur Sequenzdaten verwendet; das Level der Aktivität und Spezifizität jedes dieser sequenzierten Rekombinasen war nicht bekannt. Mittels einer neuen Sequenziertechnologie, des Nanoporesequenzierens, war es mir möglich, sowohl die Aktivität, sowie die Genesequenz im hohen Durchsatz zu bestimmen. Diese neue Art Informationen zu sammeln, wird essenziell sein neue Modelle zu trainieren welche eine verbesserte Effektivität haben und in Zukunft die zielgerichtet Evolution fast komplett ersetzen sollen. Die Screeningmethode ist vor kurzem (Oktober 2023) als Publikation bei "Genome Biology" akzeptiert worden, und wird auch für die Entwicklung von vielen anderen Genveränderungsenzymen relevant sein.

Die hier erwähnten Errungenschaften durch die Dissertationsarbeit zeichnen sich äußerst positiv auf das Ansehen Dresdens und der TU-Dresden aus. Weiterhin, wird die Arbeit die Basis für weitere Errungenschaften durch Seamless Therapeutics, einem Dresden basierten Start-Up, sein.

Nächste Ziele und Vorhaben

Mittlerweile wird die Arbeit meiner Dissertation in Seamless Therapeutics von mir als Projektleiter weitergeführt. Seamless Therapeutics ist ein Start-Up, welches aus der Forschungsgruppe von Prof. Dr. Buchholz ausgegründet wurde, und sich auf die Entwicklung von Ortsspezifischen Rekombinasen spezialisiert hat. Mit 12.5 Millionen Euro Startförderung erreichte das Unternehmen die Aufmerksamkeit der Biotechnologiebranche. Die hier entwickelten Methoden bilden einen wichtigen Teil des Portfolios von Seamless Therapeutics. Damit trugen sie bereits einen signifikanten Beitrag zum Erlangen der hohen Fördergeldsumme und sie werden für die zukünftige Entwicklung des Unternehmens entscheidend sein.